Zur Seitenansicht
 

Titelaufnahme

Titel
Untersuchungen zur Charakterisierung und Standardisierung von Allergenextrakten aus Milbenkulturen / von Ulrich Deppe
AutorDeppe, Ulrich In der Gemeinsamen Normdatei der DNB nachschlagen
Erschienen2002
HochschulschriftPaderborn, Univ., Diss., 2002
SpracheDeutsch
DokumenttypDissertation
URNurn:nbn:de:hbz:466-2002010152 Persistent Identifier (URN)
Dateien
Untersuchungen zur Charakterisierung und Standardisierung von Allergenextrakten aus Milbenkulturen [2.94 mb]
zusfasng [62.82 kb]
abstract [61.34 kb]
Links
Nachweis
Klassifikation

Deutsch

Allergenextrakte zur Diagnostik und Therapie werden im deutschen Arzneimittelgesetz als Arzneimittel klassifiziert und unterliegen somit den entsprechenden Qualitätskriterien. Bei Arzneizubereitungen mit und ohne wirksamkeits-bestimmenden Substanzen ist der gesamte Anteil des „Extraktes“ maßgebend und auch qualitätsbestimmend, d.h. eine Normierung auf nur einen Inhaltsstoff kann somit nicht erfolgen. Das Fehlen nationaler und internationaler Standards bedingt große Qualitätsunterschiede zwischen den Präparaten verschiedener Hersteller und erfordert so eine komplexe und aufwendige Qualitätssicherung. Qualität ist bei der Herstellung von Allergenextrakten kein wohl definierter, allgemein anerkannter und geprüfter Zustand, sondern eine individuelle Interpretation des Herstellers. Als einzige Vorgabe zur Qualitätssicherung und -erreichung wird daher gefordert, dass Herstellungs- und Kontrollmethoden nach dem jeweiligen „Stand der wissenschaftlichen Erkenntnis“ angewandt werden müssen. Eine in-vivo Hauttestung zur biologischen Aktivität ist nur bei der erstmaligen Zulassung des Präparates vorgeschrieben, die nachfolgende Chargenkontrolle erfolgt in-vitro. In Ermangelung verbindlicher nationaler und/oder internationaler Vorgaben zur Allergenstandardisierung und Qualitätskontrolle werden Extrakte hinsichtlich ihrer globalen Aktivität auf biologischer Basis (Histaminäquivalent im Pricktest), und durch eine in-vitro-Methodik (z.B. EAST-Inhibition oder Histamiliberation) eingeschätzt. Die Standardisierung der Allergenstandards anhand biologischer Einheiten ist sinnvoll, da sie die Summe aller individuellen Aktivitäten repräsentieren. Allerdings sind keinerlei Rückschlüsse auf individuelle Allergenkonzentrationen möglich, so dass eine hohe Aktivität u.U. auch ohne Majorallergene zustande kommen kann. Betrachtet man die allergene Aktivität eines Allergenextraktes als die Summe einzelner Komponenten, wobei jede Komponente bzw. jedes Allergen einen individuellen Beitrag liefert, so bekommt die Bestimmung von Einzelallergenen und die Zuordnung individueller spezifischer Aktivitäten eine neue Bedeutung. In der vorliegenden Arbeit wurden zu diesem Zweck u.a. Untersuchungen zum schonenden Aufschluss von Milbenkulturen, zur physikalisch-chemischen Charakterisierung, zur funktionellen Aktivität des Extraktes sowie zur Fragmentierung und Struktur der allergenen Komponenten unternommen. Objekt der Untersuchungen waren Kulturen der Hausstaubmilbe Dermatophagoides pteronyssinus verschiedener Hersteller und eine Kultur der Vorratsmilbe Lepidoglyphus destructor. Milbenreinkulturen als auch mit Kulturmedien versetzte Kulturen waren zur Charakterisierung geeignet. Unterschiede zwischen den verwendeten Aufschlussmedien Cocas‘-Lösung und Ammoniumhydrogencarbonat wurden nicht festgestellt. Der Zusatz von Polyethylenglykol führte zu qualitativen Veränderungen im Extrakt, deren Bewertung allerdings noch weiterer Untersuchungen bedarf. Die Dialyse zur Abtrennung niedermolekularer Komponenten ist aufgrund erhöhter Fragmentierung und latenter Proteaseaktivität der Milbenextrakte zu vermeiden. Eine verbesserte Lagerfähigkeit der Extrakte konnte durch eine Lyophilisation erreicht werden. Diese führte zu einer Verschiebung des Fragmentierungsmusters hin zu niedermolekularen Fragmenten, andererseits konnte ein Allergenspektrum über den gesamtem Molekulargewichtsbereich in der spezifischen IgE-Bestimmung durch Inkubation mit Patientenseren erhalten werden. Gegenüber einer präparativen Isolierung durch Ammoniumsulfatfällung (Cohnsche Fraktionierung) zeigten sich die Extraktproteine stabil, DNS-Fragmente konnten nicht ausgefällt werden. Das erhaltene Verhältnis der Majorallergene Der p 1 und Der p 2 zueinander bestätigte für alle Extrakte aus D. pteronyssinus Kulturen die Klassifizierung als „Purified Body“-Kultur. Die durchgeführte Ausschlusschromatographie erlaubte eine schnelle Bestimmung der im Extrakt vorhandenen scheinbaren Molekulargewichtsfraktionen sowie eine Einschätzung der Veränderungen durch vorhergehende Aufbereitungsschritte wie z.B. eine Dialyse oder die Lyophilisation. Qualitative Veränderungen im Proteinspektrum konnten durch die SDS-PAGE und die IEF dokumentiert werden. Die Reaktionen der Extrakte beider Milbenspezies gegenüber den Patientenseren entsprachen bis auf wenige Ausnahmen der Literatur. Eine aus der Taxonomie heraus erklärbare Verschiedenheit der beiden Milbenspezies konnte im Immunoblot deutlich herausgearbeitet werden. Die in der Literatur aufgezeigte Bindungsfrequenz für Der p 1 in Patientenseren von ~80 % konnte nicht bestätigt werden. Die Proteaseaktivitätsbestimmung der Lyophilisate mittels Casein-Zymogramm zeigte unterschiedliche Molekulargewichtsbereiche und herkunfts-spezifische Gesamtaktivitäten den Ursprungskulturen (Europa vs. Australien) der Spezies D. pteronyssinus auf. Ob es sich hierbei um in der Ursprungskultur begründete Unterschiede oder um produktionstechnische Effekte wie z.B. durch Gefriertrocknung handelte, konnte nicht zugeordnet werden. Die MALDI-TOF-Massenspektroskopie konnte als hoch effektives Analyseverfahren erstmals auf komplexe Milbenextrakte angewandt werden. Ergebnisse durchgeführter Immunreaktionen sowie chromatographischer und elektrophoretischer Trennverfahren konnten im Detail bestätigt und zugeordnet werden.

English

Allergen extracts for medical diagnostics and therapy are classified as drugs in German pharmaceutical law and are thus subject to according quality criteria. Because of the non-existence of national or international standards, there are large differences in the quality of compounds of different producers. Therefore, a complex and elaborating quality assurance is required. Quality is not a well defined, generally accepted and proofed state, hence it is subjected to the individual interpretation of the manufacturer. Internal comparisons are not required. If carried out, they would result in large quality differences. Today, the single requirement for quality assurance is manufacturing according to “the current scientific state of the art”. Only during first admission of a new drug an in-vivo prick-testing is required, controlling of following production charges can be done by simple in-vitro-testing. Because of the non-existence of national and/or international guidelines for allergen standardisation and quality control, the global activity of allergen extracts are estimated on a biological basis (histamin equivalent in prick testing)and by an in-vitro method like EAST-inhibition or histamin liberation. Standardisation of allergen standards on the basis of biological units are very useful since they correlate to all individual activities present. However, it is impossible to draw conclusions about individual allergen concentrations, i.e. a high allergen activity could also be achieved without major allergens. If the allergen activity of a whole extract would be considered as the sum of the single components and every single allergen yields an individual contribution, the estimation of single allergens and the correlation to individual specific activities becomes a new meaning. Due to this fact the following investigations were carried out in this work: gently pulping of mite cultures, physico-chemical characterisation, functional activity of allergen extracts and fragmentation and structure elucidation of the allergen components had been done. Cultures of the house dust mite Dermatophagoides pteronyssinus from different suppliers and one culture of the storage mite Lepidoglyphus destructor were the objects of the investigation. Purified mite cultures and whole mite cultures are both suitable for characterization. Differences between the two pulping-media Cocas- and Ammonium-hydrogene-carbonat-solution were not observed. The addition of polyethyleneglycol resulted in qualitative changes of the extract. Dialysis for separating low-molecular components has to be avoided because of an increased fragmentation and latent proteolytic activity. An increased shelf life was achieved by lyophilisation which gave a shift in fragmentation pattern to low molecular weights. Otherwise an allergen pattern over the whole molecular weight range was found by specific incubation with patient sera.