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Zusammenfassung

Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Etablierung eines Modellsystems basierend auf dem Farbstoff Pseudoisocyaninchlorid (PIC) zur Untersuchung von Aggregationsprozessen in Biosystemen mit Hinblick auf Crowding-Effekte. Im Falle von PIC wird das Produkt der Selbstassemblierung J-Aggregat genannt, welche bei gegebener Konzentration gebildet werden, sobald die Aggregationstemperatur unterschritten wird. Dabei handelt es sich um fibrilläre Strukturen, ähnlich wie die Aggregate von amyloidogenen Proteinen. Um den Mechanismus der Bildung von J-Aggregaten sowie deren Struktur zu untersuchen, wurde sich in dieser Arbeit der statischen und dynamischen Lichtstreuung bedient. Die Bestimmung der Konzentrationsabhängigkeit der Aggregationstemperatur sowie die Charakterisierung der Bildung von PIC Oligomeren wurde mit UV-Vis Spektroskopie untersucht. Um Crowding-Effekte, und somit die zelluläre Situation, zu simulieren wurden vier verschiedene Stoffe genutzt, Triethylenglycol (TEG), Polyethylenglycol (PEG), Ficoll 400 sowie Sucrose. Ergänzend wurden in vivo Experimente in HeLa-Zellen in Kooperation mit dem Arbeitskreis Ebbinghaus in Braunschweig durchgeführt. Es wurde außerdem eine Methode entwickelt, um die Probenzusammensetzung von PIC oberhalb und unterhalb der Aggregationsschwelle zu quantifizieren. Dies ermöglicht die Beschreibung der Konzentrationen von Monomeren, Oligomeren (N 3) und J-Aggregaten. Zusätzlich wurde die Selbstassemblierung von Fibrinogen in Abwesenheit von Thrombin mittels zeitaufgelöster statischer und dynamischer Lichtstreuung analysiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass der Mechanismus der Selbstassemblierung einer Koagulation entspricht. Es werden globuläre Strukturen gebildet. Die Einführung des synthetischen Crowders Ficoll 400 führt zu einer beschleunigten Aggregation.

Abstract

The scope of the present work is the establishment of a model system based on the dyestuff pseudo isocyanine chloride (PIC) as a tool to investigate self-assembly processes in biological systems with special regard to crowding effects. In case of PIC, the product of self-assembly is called J-aggregate, which are found at a given concentration when the aggregation temperature is undershoot. They are characterized as fibrillar structures, similar to the aggregates originated from amyloidogenic proteins. Investigation of the mechanistic features of J-aggregate formation as well as the characterization of the aggregate structure has been done with static and dynamic light scattering. Determination of the concentration dependency of the aggregation temperature together with the characterization of the formation of PIC oligomers has been carried out with UV-Vis spectroscopy. To simulate crowding effects, and therefore simulate a cellular environment, four different chemicals were used, triethylene glycol (TEG), polyethylene glycol (PEG), Ficoll 400 and sucrose. Complementing this, in vivo experiments in HeLa cells were conducted in cooperation with the working group Ebbinghaus in Braunschweig. Furthermore, a method was developed to quantify the sample composition of PIC above and below the aggregation threshold. This method enables the description of the concentration of monomers, oligomers (N 3) and J-aggregates. The transition to a biological relevant system was established with the analysis of the protein fibrinogen. The self-assembly of fibrinogen in the absence of thrombin was investigated with time-resolved static and dynamic light scattering. It could be shown that the underlying mechanism of the self-assembly is classified as a coagulation. Globular structures are generated. Introduction of the synthetic crowder Ficoll 400 lead to an accelerated aggregation.