English

Tetracyclines, broad spectrum antibiotics, are widely used in lifestock farming. Especially chlortetracycline (CTC) is frequently added to feed for the treatment of bacterial diseases in pigfattening. As a consequence, antibiotic residues remaining in animal products may promote the development and distribution of bacterial resistance to antibiotics. It has been recognized in the European Union´s legislation on the control of veterinary drug residues, that tetracyclines produce epimers. The maximum residue limits (MRL) for tetracyclines in edible animal tissues have been defined as the sum of the parent drug and the epimers. CTC gives rise not only to the epimer (e-CTC) but further microbial and toxicological relevant conversion and degradation products (also called “metabolites”). These metabolites are not detectable with previous validated methods. This work aimed to get more information on the fate of CTC in pig production. To estimate the chlortetracycline levels in excreta and remaining residues in carcass samples two medication studies were carried out under controlled conditions (Haus Düsse, Bad Sassendorf, and FAL Braunschweig). Piglets were reared without antibiotic medication and then treated with chlortetracycline at the limit of the typical therapeutical dose. Firstly, analytical methods for the quantification of CTC and e-CTC in urine, faeces, and plasma as well as in bones, muscle, liver and kidney were developed and validated according to international guidelines. These methods include the extraction of the samples with McIlvaine-buffer, following by a cleanup-step with solid phase extraction (Oasis HLB) and finally the chromatographic identification and quantification with HPLC-UV-MS/MS. The results from the medication studies supply evidence for a formation of iso-CTC und eiso-CTC and small amounts of anhydro-CTC und e-anhydro-CTC in addition to e-CTC. In consequence, the analytical method was extended to include the quantitative determination of these additional metabolites of CTC. A method for the quantification of e-iso-CTC was developed, which is commercially not available as reference standard. The e-iso-CTC can be prepared in situ by epimerization of iso-CTC in standard solution. Furthermore another metabolite could be detected. It was identified by mass spectrometry (LC-MSMS-technique) based on typical fragmentation reactions, as the keto-tautomer of e-CTC. Evidence is given, that the various chlortetracycline metabolites can be formed in vitro, during sample preparation depending on the conditions of sample pretreatment (e.g. pH, solvent), as well as in vivo. A detailed mass balance study of the antibiotics applied to pigs showed that high amounts of CTC were excreted mainly via faeces (88 %) and to a lesser extent via urine (5 %). The remaining drug amount in the animal predominantly accumulates in bones (2.75 %). Comparatively small amounts were found in muscle (0.09 %), liver (0.005 %) and kidney (0.001 %). Important implications result from the fact that in all carcass samples not only CTC and e-CTC were detected, but also the isomers and small amounts of the anhydro compounds. Therefore, the determination of residual chlortetracycline levels should not be restricted to the sum of the contents of CTC and its epimer. Also the non active compounds iso-CTC and eiso-CTC and the toxic degradation products anhydro-CTC and e-anhydro-CTC should be taken into account, which can be also potent on tetracycline resistance strains. Based on the data obtained the total sum of CTC concentrations could frequently exceed MRL. In this work analytical methods were developed and validated which can be used in routine analysis. These methods lead to new findings, relevant to the protection of the consumer, and broaden facilities for the control of food from animal origin.

Deutsch

Tetracycline zählen zu den in der landwirtschaftlichen Tierhaltung verordnungsstärksten Antibiotika. Von besonderer Bedeutung ist Chlortetracyclin (CTC), das vor allem bei Schweinen als Fütterungsarzneimittel eingesetzt wird. Die intensive Anwendung dieses Antibiotikums ist durch mögliche Einträge in die Nahrungskette über Lebensmittel tierischer Herkunft mit dem steigenden Risiko der Resistenzentstehung verbunden. Da Tetracycline Epimere bilden, ist für Kontrolluntersuchungen gesetzlich vorgeschrieben, die Rückstände in Muskulatur, Leber, Niere, Milch und Eier als Summe von Muttersubstanz und Epimeren zu ermitteln. Bestimmte Grenzwerte (MRL = Maximum Residue Limit) dürfen nicht überschritten werden. Neben dem Epimeren (e-CTC) bildet CTC aber weitere mikrobiell und toxikologisch relevante Umwandlungs- und Abbauprodukte (auch „Metabolite“ genannt), die bisher mit validierten Analysenverfahren nicht bestimmbar waren. Zur Aufklärung dieser besonderen, noch ungeklärten Rückstandsproblematik wurden zwei Medikationsstudien unter kontrollierten Bedingungen durchgeführt (Haus Düsse, Bad Sassendorf, und FAL Braunschweig). Dazu wurden arzneimittelfrei aufgezogene Ferkel nach der Aufstallung unter praxisnahen therapeutischen Bedingungen definiert medikamentiert. Es sollte sowohl das Ausscheidungsverhalten von CTC anhand von Kot- und Urinproben untersucht als auch die verbleibenden Rückstände in Schlachtproben analysiert werden. Deshalb wurden in einem ersten Schritt Analysenverfahren zur Bestimmung von CTC und e-CTC in Urin, Faeces und Plasma sowie in Knochen, Muskulatur, Leber und Niere entwickelt und nach international gültigen Richtlinien umfassend validiert. Diese Verfahren umfassen die Extraktion der Proben mit McIlvain-Puffer, eine Aufreinigung und Aufkonzentrierung der Extrakte mit Festphasenextraktion (Oasis HLB) und die chromatographische Identifizierung und Quantifizierung mit HPLC-UV-MS/MS. Die Analysedaten aus den Medikationsstudien ergaben, daß neben dem Epimeren des CTC auch in hohem Maße die isomeren Verbindungen iso-CTC und e-iso-CTC sowie in geringen Mengen Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC nachweisbar sind. Das Analysenverfahren wurde daher für die quantitative Bestimmung dieser zusätzlichen Metabolite erweitert. Insbesondere wurde eine Methode entwickelt, um das kommerziell nicht erhältliche e-iso-CTC durch Epimerisierung des iso-CTC in Standardlösung herzustellen. Darüber hinaus konnte ein weiterer Metabolit, und zwar das Keto-Tautomer des e-CTC, in den Proben massenspektroskopisch (LC-MS/MS-Technik) identifiziert werden. Die Untersuchungen machten deutlich, dass diese zusätzlichen CTC-Komponenten sowohl in vivo als auch in vitro während der Probenaufbereitung in Abhängigkeit vom Lösungsmittel und pH-Wert entstehen. Eine detaillierte Bilanzierungsstudie ergab, daß ein Großteil der den Tieren applizierten, definierten Wirkstoffmenge hauptsächlich über Faeces (88 %) und geringfügig über Urin (5 %) ausgeschieden wird. Von der im Tier verbleibenden Menge lagert sich der größte Teil (2,75 %) im Knochen ein. Vergleichsweise geringe Gehalte wurden in Muskulatur (0,09 %), Leber (0,005 %) und Niere (0,001 %) gefunden. Von besonderer Relevanz ist dabei die Tatsache, daß in allen Schlachtproben neben CTC und e-CTC zusätzlich die Isomeren und in geringfügigerem Maße die Anhydro-Verbindungen nachgewiesen wurden. Diese Chlortetracyclin-Metabolite sollten daher bei Rückstandskontrollen, die bisher auf die Summengehalte von CTC und e-CTC beschränkt sind, mit einbezogen werden. Dadurch sind Überschreitungen der MRL-Werte nach den vorliegenden Daten durchaus möglich. Die in dieser Arbeit entwickelten routinefähigen, validierten Methoden führten somit zu neuen, verbraucherschutzrelevanten Erkenntnissen und erweiterten Möglichkeiten bei der Kontrolle vom Tier stammender Lebensmittel.