English

The existence of locally regular secondary structure motifs, such as helices, sheets, or turns, plays a central role for the biological function of proteins. However, open questions remain the thermodynamic stability of the secondary structure motifs. In particular, the intrinsic stability , i.e., the stability in the absence of any environmental effects, has -- on the basis of experimental studies -- not been acquired yet, even for the most abundant secondary structure motif, the helix. A detailed understanding of the intrinsic stability is in turn fundamental for a systematic theory of protein folding. Accurate theoretical studies of model systems are therefore highly desirable.

Density functional theory (DFT) is a powerful electronic structure method which meets the high requirements on accuracy demanded by these systems. However, existing DFT studies on helices focus on the static stability at the absolute temperature zero point and do not account for the strong thermal vibrations which occur at the biologically relevant temperature range. In this project we have therefore faced the challenge to employ DFT to determine the temperature dependence of the intrinsic helix stability.

The study includes all three experimentally observed helix types, i.e, the alpha-, the pi- and the 3-10-helix. Further it includes several unfolded conformations, which serve as reference for the stability analysis. A key quantity to address the helix stability is the free energy. In the present study the free energy has been determined from the harmonic phonon spectrum, which in turn is determined from the dynamical matrix. In order to achieve the extreme high numerical accuracy required for this project, we had to extend the established standard methodology for calculating the dynamical matrix by a novel method, consisting of a three-stages refinement scheme. To further refine the results, we then extended the study by explicitly calculating anharmonic effects. We therefore have implemented the thermodynamic integration approach and combined it with an efficient stochastic Langevin dynamics scheme, which shows a dramatic increase in the computational efficiency as compared to common deterministic molecular dynamics schemes.

Employing this novel approach on the poly-L-alanine chain we are able to demonstrate that vibrational entropy plays a key role for the stability of the helix in the biologically relevant temperature range, since it strongly reduces the phase stability of the helices compared to the unfolded states. Nonetheless, we find that the enthalpic contributions arising from the cooperative hydrogen bond network of the alpha-helix are still sufficiently strong to make it the most stable bulk phase at room temperature, and also stable against unfolding. These results provide a very fundamental conclusion: The alpha-helix is intrinsically stable at room temperature, without the need of environmental effects, such as solvent or pressure. Furthermore, our results reveal trends on the temperature dependence of the relative stability between the three helix types. Most important, the pi-helix exhibits a significant entropic ``penalty'' with respect to the two other helix types. By carefully mapping our DFT data on an analytical model, we show that this trend is almost exclusively driven by the geometric peculiarities of the pi-helix as compared to the alpha-helix and 3-10-helix. Since these peculiarities are roughly independent of the specific amino acid sequence and of the environment, they rationalize why the pi-helix is in general the least common of the three helix types in proteins.

Based on these insights we have studied the impact of the side chain of the amino acids, which constitute the basic building blocks of the proteins, on the helix stability by performing a detailed comparative analysis between chains composed of two different amino acids, glycine and L-alanine. According to the experimental results, glycine is a very weak helix former, whereas L-alanine is a very strong helix former. The origin of this difference has not been clarified yet. By means of our approach we can show that vibrational free energy contributions significantly lower the glycine helical propensities compared to L-alanine, which also verifies that helical propensities of the amino acids already exist in the absence of any environmental effects.

Deutsch

Die Existenz von lokal geordneten Sekundärstrukturelementen, z.B. Helices oder auch Faltblattstrukturen, ist von zentraler Bedeutung für die biologische Funktion von Proteinen. Dennoch bleiben offene Fragen bezüglich der Stabilität dieser Sekundärstrukturelemente. Insbesondere die intrinsische Stabilität, also die Stabilität in Abwesenheit jeglicher äußerer Einflüsse, konnte -- basierend auf experimentellen Studien --- bisher nicht erfasst werden, nicht einmal für das am häufigsten vorkommende Sekundärstrukturelement, die Helix. Eine detaillierte Kenntnis der intrinsischen Stabilität ist jedoch eine Grundvorraussetzung für ein systematisches, theoretisches Verständnis der Proteinfaltung. Deswegen sind genaue theoretische Studien von idealisierten Helices unersetzlich.

Die Dichtefunktionaltheorie (DFT) ist eine universell einsetzbare, theoretische Methode zur Beschreibung der elektronischen Struktur von poly-atomaren Systemen, welche die hohen Anforderungen, die die Simulation der Helix an die Genauigkeit stellt, grundsätzlich erfüllt. Jedoch konzentrieren sich bisherige DFT-Studien von Helices im Wesentlichen auf die statische Stabilität am absoluten Temperaturnullpunkt und lassen die ausgeprägten thermischen Schwingungen des Systems im biologisch relevanten Temperaturbereich außer Acht. Deshalb haben wir uns im Rahmen dieser Studie der Herausforderung gestellt, die Temperaturabhängigkeit der intrinschen Helix-Stabilität mit Hilfe der DFT zu bestimmen.

Die Studie umfasst alle drei experimentell beobachteten Helix-Typen, d.h., die alpha-, die pi- und die 3-10-Helix und außerdem verschiedene ungefaltete Konformationen, die als Referenz für die Stabilitätsanalyse dienen. Eine zenrale Größe für die Bestimmung der Helix-Stabilität ist die freie Energie. Letztere wird in der vorliegenden Studie aus dem harmonischen Phononenspektrum bestimmt, welches seinerseits aus der dynamischen Matrix bestimmt wird. Um die extrem hohe numerische Genauigkeit zu erreichen, die für dieses Projekt nötig war, haben wir die etablierte Standardmethodologie zur Berechnung der dynamischen Matrix um eine neuartige Methode erweitert, die ein dreistufiges Verfeinerungsverfahren beinhaltet. Um die Ergebnisse weiter zu verfeinern, haben wir die Studie außerdem um die Berechnung anharmonischer Effekte erweitert. Hierfür haben wir die Methode der thermodynamischen Integration implementiert und sie mit einem effizienten stochastischen Langevindynamikverfahren kombiniert, was eine drastische Erhöhung der Recheneffizienz im Vergleich zu herkömmlichen, deterministischen Verfahren der Moleküldynamik zur Folge hatte.

Mit Hilfe dieses neuartigen Ansatzes konnten wir für das Beispiel einer poly-L-Alanin Kette zeigen, dass die Entropie der Schwingungszustände die Stabilität der drei untersuchten Helix-Phasen im Vergleich zum ungefalteten Zustand deutlich reduziert uns somit eine zentrale Rolle für die Stabilität der Helix im biologischen relevanten Temperaturbereich spielt. Nichtsdestotrotz haben wir auch ermittelt, dass die stabilisierenden Beiträge, welche durch das kooperative Netzwerk der Wasserstoffbrücken in der Helix bestimmt werden, immer noch ausreichend groß sind, um die alpha-Helix bei zur stabilsten thermodynamischen Phase bei Zimmertemperatur zu machen, und sie vor dem Übergang in den Entfalteten Zustand zu bewahren. Diese Ergebnisse lassen eine grundlegende Schlussfolgerung zu: Die alpha-Helix ist bei Zimmertemperatur intrinsisch stabil, ohne die Hilfe von äußeren Einflüssen, also z.B. Lösungsmittel oder Druck. Darüberhinaus liefern unsere Ergebnisse wichtige Trends für die relativen Stabilitätsunterschiede zwischen den drei Helix-Typen. Von größter Bedeutung ist ein entropisches Handicap'', das die pi-Helix im Vergleich zu den anderen beiden Helix-Typen tragen muss. Indem wir unsere DFT Daten auf ein analystisches Modell abbilden, können wir zeigen, dass diesesHandicap'' fast ausschließlich durch die geometrischen Eigenheiten der pi-Helix im Vergleich zur alpha-Helix und zur 3-10-Helix verursacht wird. Da diese Eigenheiten im Wesentlichen unabhängig von der spezifischen Aminosäurenanordnung und der Umgebung sind, erklären sie grundlegend, warum die pi-Helix generell der am seltensten vorkommende Helix-Typ in Proteinen ist.

Basierend auf diesen Einsichten haben wir den Einfluss der Seitengruppe der Aminosäuren, also der Grundbausteine der Proteine, auf die Helix-Stabilität untersucht, indem wir eine vergleichende Analyse zwischen zwei Peptid-Ketten angestellt haben, wovon die eine aus Peptiden der Aminosäure L-Alanin und die andere aus Peptiden der Aminosäure Glycin zusammengesetzt war. Entsprechend der Resultate von experimentellen Studien lassen sich mit Glycin nur sehr schwer Helices erzeugen, wohingegen L-Alanin sehr stark dazu neigt, Helices auszubilden. Die Ursache für diese Unterschiede ist noch unbekannt. Mit Hilfe unseres Ansatzes können wir zeigen, dass die Schwingungsbeiträge zur freien Energie die Helixpropensität von Glycin im Vergleich zu L-Alanin deutlich verringern, was auch beweist, dass die Aminosäuren schon in der Abwesenheit jeglicher äußerer Einflüsse unterschiedliche Helixpropensitäten aufweisen.